1.限制性内切酶实验问题指南

2.高保真限制性内切酶常见问题解答

Q. 为什么 HF 内切酶推荐使用的缓冲液与野生型的内切酶不同？

A. 在许多情况下，突变导致高保真内切酶的最适缓冲液发生变化。比如，野生型 SalI 酶的最适缓冲液 NEBuffer 3.1 是高离子强度缓冲液，然而 SalI-HF^™ 的最适缓冲液为中等离子强度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用 CutSmart 缓冲液有什么优势吗？

A. 是的，超过 200 种限制性内切酶（包括高保真限制性内切酶）在 CutSmart 缓冲液中有活性。当建立双酶切
反应时有很大优势。 

3.转化反应问题解决指南                

下面的指南可用于解决转化过程中所出现的问题。

无菌落或液体培养基中无细菌生长
• 即使 T7 表达为严格调控型，但是 T7 表达宿主菌中也可能存在低水平的基础表达。如果表达的蛋白可能有毒
  性，表达质粒的转化应使用下列系统：
• I^q 菌株中过量表达的 LacI^q 抑制物能够降低 T7 RNA 聚合酶的基础表达。
• 在 lysY 菌株中，突变的 T7 溶解酶与 T7RNA 聚合酶相结合，从而减少目的蛋白的基础表达。诱导后，新合
  成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作用，目的蛋白得到表达。
• 30℃ 或室温培养也可减轻毒性问题。
• 检查抗生素浓度（用对照质粒检测）。、

电泳无蛋白或无蛋白活性
• 检查毒性—细胞可能删除或缺失了表达质粒的元件。如果有毒性表达问题，试用I^q和/或 lysY 宿主以减少基础
  表达。
• 培养用于诱导蛋白表达的细胞。诱导前，将样品平行涂布于有抗生素和无抗生素选择标记的平板。如果有毒性
  产生，则两个平板菌落数会有显著的不同。在含抗生素的平板上，菌落生长数量极少（表明质粒丢失了）。

诱导蛋白不可溶

T7 表达蛋白经常产量非常高，导致目的蛋白不可溶，解决方案如下：
• 低温诱导（低温 12-15℃ 过夜）
• 降低 IPTG 浓度至 0.01 mM-0.1 mM
• 缩短诱导时间（可以缩短至 15 分钟）
• 细胞生长早期开始诱导（OD₆₀₀ = 0.3 或 0.4）