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限制性内切酶实验问题指南

2020/3/23 13:08:13      点击:

1.限制性内切酶实验问题指南


 

 

2.高保真限制性内切酶常见问题解答

Q. 为什么 HF 内切酶推荐使用的缓冲液与野生型的内切酶不同?

A. 在许多情况下,突变导致高保真内切酶的最适缓冲液发生变化。比如,野生型 SalI 酶的最适缓冲液 NEBuffer 3.1 是高离子强度缓冲液,然而 SalI-HF 的最适缓冲液为中等离子强度的 NEBuffer 2.1 CutSmart

Q. 使用 CutSmart 缓冲液有什么优势吗?

A. 是的,超过 200 种限制性内切酶(包括高保真限制性内切酶)在 CutSmart 缓冲液中有活性。当建立双酶切
反应时有很大优势。 

 

3.转化反应问题解决指南                

下面的指南可用于解决转化过程中所出现的问题。

 

无菌落或液体培养基中无细菌生长
• 即使 T7 表达为严格调控型,但是 T7 表达宿主菌中也可能存在低水平的基础表达。如果表达的蛋白可能有毒
  性,表达质粒的转化应使用下列系统:
Iq 菌株中过量表达的 LacIq 抑制物能够降低 T7 RNA 聚合酶的基础表达。
• 在 lysY 菌株中,突变的 T7 溶解酶与 T7RNA 聚合酶相结合,从而减少目的蛋白的基础表达。诱导后,新合
  成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作用,目的蛋白得到表达。
• 30℃ 或室温培养也可减轻毒性问题。
• 检查抗生素浓度(用对照质粒检测)。、

 

电泳无蛋白或无蛋白活性
• 检查毒性—细胞可能删除或缺失了表达质粒的元件。如果有毒性表达问题,试用Iq和/或 lysY 宿主以减少基础
  表达。
• 培养用于诱导蛋白表达的细胞。诱导前,将样品平行涂布于有抗生素和无抗生素选择标记的平板。如果有毒性
  产生,则两个平板菌落数会有显著的不同。在含抗生素的平板上,菌落生长数量极少(表明质粒丢失了)。

 

诱导蛋白不可溶

T7 表达蛋白经常产量非常高,导致目的蛋白不可溶,解决方案如下:
• 低温诱导(低温 12-15℃ 过夜)
• 降低 IPTG 浓度至 0.01 mM-0.1 mM
• 缩短诱导时间(可以缩短至 15 分钟)
• 细胞生长早期开始诱导(OD600 = 0.3 或 0.4)