单细胞测序技术是近年来迅速发展的生命科学前沿技术，它在单细胞水平揭示细胞的基因表达状态，反映细胞间的异质性，为生命科学的研究提供了独特的视角。近年来，单细胞测序技术在神经科学、肿瘤、发育生物学、微生物学等众多领域发挥着重要的作用，成为了生命科学极具潜力的热点研究工具。单细胞测序结果的真实性，不同检测信息在组织中的特异分布，与检测结果的生物学意义密切相关。故在单细胞测序后重要靶点的原位回溯具有重要的生物学分析意义。RNAscope原位杂交技术能直观可视化基因表达的空间位置，无惧新发现靶点无免疫组化抗体，分泌因子或者靶点为非编码RNA等情况，因此RNAscope对于单细胞测序的结果回溯到组织原位上进行验证提供了重要的技术手段。本文为大家解读2020年发表的使用RNAscope技术在单细胞测序后验证中的应用系列文章。

2020年在communication biology上发表的一篇题为Single-cell Transcriptomes of The Human Hkin Reveal Age-related Loss of Fibroblast Priming的研究中，利用单细胞测序系统分析了人皮肤成纤维细胞的转录组，鉴定了四个主要的成纤维细胞亚群，这些亚群可以在空间上定位并显示不同的分泌、间充质和促炎功能，为人类真皮成纤维细胞的功能特化提供了证据，并且发现细胞特性的部分丧失是人类真皮中与年龄相关的重要变化。

在这项研究中，研究人员从两名年轻（25岁和27岁）和三名年长（53岁、69岁和70岁）的捐赠者身上获取了全皮肤样本，而且为了尽量减少皮肤的光老化效应，这些样本是从男性捐赠者的防晒区域的腹股沟髂区获得的。然后对获得的皮肤样本进行单细胞测序，单细胞测序结果以及数据分析鉴定了4个成纤维细胞亚群，第一个亚群是位于网状真皮中的分泌性网状成纤维细胞，第二个亚群是位于乳头状真皮中的分泌性乳头状成纤维细胞，第三个亚群被预测具有广泛的定位，显示出更大的间充质潜能的间充质成纤维细胞，第四个亚群是促炎症细胞群（见下图）。

为了进一步表征和验证单细胞测序鉴定的四个成纤维细胞亚群，研究人员使用Bio-Techne旗下ACD公司的RNAscope技术，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）皮肤切片中原位检测了每个亚群最具代表性的标志基因的表达。研究人员使用的是RNAscope多通道荧光检测的方法，分别检测了分泌性网状成纤维细胞的标志基因CTHRC1（下图a中绿色信号点）和分泌性乳头状成纤维细胞的标志基因APCDD1的表达（下图a中红色信号点），并检测了泛成纤维细胞标志基因PDGFRA的表达作为对照（下图a中白色信号点），RNAscope的检测结果证实了每个分泌亚群在乳头状真皮层和网状真皮层中的位置，并且通过RNAscope结果的定量分析可以统计分别表达CTHRC1与APCDD1的阳性细胞比例，从而得到在乳头状真皮层和网状真皮层中两个分泌亚群细胞的相对数量。

对于另外两个成纤维细胞亚群，研究人员同样使用RNAscope多通道荧光检测的方法，分别检测了促炎成纤维细胞的标志基因CCL19与APOE的表达（下图b中绿色信号点为RNAscope检测到的CCL19的RNA信号，红色信号点为APOE的RNA信号），与间充质亚群的标志基因ASPN的表达（下图c中绿色信号点）。RNAscope的检测结果证实促炎成纤维细胞显示出更广泛的分布，在脉管中的分布证实其与血管系统的优先关联。间充质亚群主要定位于网状真皮，尤其是毛囊附近。因此，RNAscope原位检测结果为研究人员通过单细胞转录组学获得的发现提供了重要的证据，并为检测特定成纤维细胞亚群建立了标记。

RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下：

应用广泛 

使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

特异性强

RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

灵敏度高

RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号的可视化。

单分子可视化和单细胞定量

使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

检测结果稳定一致性

RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

多通道多靶点同时检测

由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。

References

1. Llorenç Solé-Boldo, Günter Raddatz, Sabrina Schütz, et al. Single-cell transcriptomes of the human skin reveal age-related loss of fibroblast priming. Commun Biol. 2020; 23;3(1):188.