限制性内切酶在不同缓冲液中的活性         

NEB 目前提供超过 200 种 CutSmart 内切酶，这些内切酶在 CutSmart 缓冲液中活性为 100%。这大大提高了内切酶的效率、灵活性和简便性，尤其是进行双酶切时。

该表总结了 NEB 所有限制性内切酶的活性信息。为了帮助您选择双酶切的最佳条件，该表列出了酶的最佳活性 NEBuffer（随酶提供）和每种内切酶在四个标准缓冲液中的活性。需要注意的是 BSA 现在已经添加到缓冲液中，不再单独提供。双酶切反应体系请参考 2013﹒2014 商品目录第 276 页。此外，活性表中列出了反应温度、热失活温度、推荐稀释液、甲基化敏感性和该酶是否有省时酶特性（即在建议的反应条件下，5-15 分钟可完全切割底物，过夜酶切也不会降解 DNA）。

注：表中数值为近似值，所用底物与内切酶定义中的底物相同，更新的内容请查阅 www.neb-china.com 及
        www.neb.com。

反应温度：

表中列出了限制性内切酶的最适反应温度。对于最适反应温度不是 37℃ 的限制性内切酶，请阅 2013﹒2014 商品目录 284 页查询其在 37℃ 时的活性。

热失活：

热失活是终止酶切反应的一种简便易行的方法。大多数最适反应温度为 37℃ 的酶，在 65℃ 条件下温育 20 分钟即可失活。一些在 65℃ 下不能失活的酶如将温度升高至 80℃，温育 20 分钟也可失活。下表注明了该酶能否进行热失活以及热失活的相应温度。

稀释缓冲液：

稀释限制性内切酶时，建议使用稀释缓冲液（A、B 或C）。建议用前稀释且稀释终浓度不要低于 1,000 units/ml。目录及说明书中标注了每一种内切酶相应的稀释缓冲液。

稀释缓冲液成份：

稀释液 A：

50 mM KCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，200 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

稀释液 B：

300 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，500 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

稀释液 C：

250 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.15% Triton X-100，200 μg/ml BSA 和 50% 甘油 (pH 7.4 @ 25℃) 。

活性注意事项：

1. 延时酶切、高酶浓度或者甘油浓度超过 5% 会导致星号活性。

2. 延长酶切时间会导致星号活性。

3. 甘油浓度超过 5% 会导致星号活性。

*在该缓冲液中可能会出现星号活性。

活性图

DNA 修饰酶在 CutSmart 反应缓冲液中的活性           

在常用的克隆酶中，选出了一系列 DNA 修饰酶，用 CutSmart 缓冲液代替随酶提供的缓冲液，进行酶活检测。比较酶在 CutSmart 缓冲液（添加必须的辅助因子）和随酶提供的缓冲液中的活性。反应体系是根据修饰酶的推荐反应体系建立的，用 CutSmart 反应缓冲液替代随酶提供的反应缓冲液。结果比较如下表中所示。

+ + + 具完全功能活性           + + 具 50-100% 功能活性                         + 具 0-50% 功能活性

星号活性（特异性降低或改变）                

在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。有人提出，这种“星号”活性可能是内切酶的一种普遍特性（1），如果提供给相应反应条件，所有内切酶都会出现非特异性切割。虽然星号活性产生的倾向性不同，但是当使用随酶提供的NEBuffer 时，内切酶不会产生星号活性。如果已经报道该酶存在星号活性，那么在产品目录、说明书和网站上会做说明。

酶识别特异性的改变受酶本身的性质及可能引起星号活性的反应条件影响。常见的引起酶识别改变的条件有：单碱基替换、识别序列外侧碱基缩短以及单链切刻（2）。有些酶显示在标准反应条件下序列特异性降低，并且有同源位点时，能够切开非同源（次级）位点（3）。

注：上述反应条件的改变对于每种酶的影响不同。

NEB 建议使用 50 μl 反应体系进行酶切。但在必须使用小体积酶切时，需要注意以上列举的各种情况以避免星号活性。
此外，可使用 NEB 的系列产品高保真内切酶（HF）可以使操作更简便。更多高保真内切酶信息请查询 NEB 的网站。

降低星号活性的 HF 内切酶                

下表为 HF 内切酶和其野生型在检测到明显星号活性前的最大酶用量。HF 指数代表在选择 HF 内切酶时酶用量增加的倍数，数据清楚显示了 HF 内切酶带来的灵活性。
 

高保真限制性内切酶            

NEB 一直致力于限制性内切酶的研究和改进，现向您提供最新系列的高保真限制性（HF）内切酶。这些酶与其野生型有相同的特性，在 CutSmart 反应缓冲液中都有活性，但经基因工程改造后降低了星号活性。星号活性或特异性降低是限制性内切酶的天然特性。大多数酶在推荐条件下反应是不会导致星号活性，然而，对于已报道有星号活性的内切酶，为避免非特异性切割，一定要按照推荐的反应条件建立反应体系。

很多技术需要在非最佳条件下使用内切酶，如：克隆、基因分型、突变检测、基因定位、探针制备、测序和甲基化检测等。HF 内切酶降低了星号活性，给酶切反应提供更多选择并能在更多情况下获得最好的切割效果。

除了降低星号活性外，所有的 HF 内切酶都能在兼容性最强的 CutSmart 反应缓冲液中达到最佳切割效果，因此简化双酶切反应。此外 HF 内切酶全都是省时内切酶，能在 5-15 分钟内消化底物。HF 内切酶与原酶的价格相同。

关于高保真内切酶更多相关信息，请查询 NEB 网站 www.neb-china.com 及 www.neb.com/HF。

高保真限制性内切酶常见问题解答

Q.为什么 HF 内切酶推荐使用的缓冲液与野生型的内切酶不同？

A. 在许多情况下，突变导致高保真内切酶的最适缓冲液发生变化。比如，野生型 SalI 酶的最适缓冲液 NEBuffer 3.1 是高离子强度缓冲液，然而 SalI-HF^™ 的最适缓冲液为中等离子强度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用 CutSmart 缓冲液有什么优势吗？

A. 是的，超过 200 种限制性内切酶（包括高保真限制性内切酶）在 CutSmart 缓冲液中有活性。当建立双酶切反应时有很大优势。 

具有省时酶特性（Time-Saver™）的限制性内切酶                

效率高，5-15 分钟实现快速酶切；纯度高，过夜酶切不降解。 

无论您是在进行大量克隆的快速筛选还是进行过夜酶切，NEB 高品质的酶都会给您带来更大的便利。通常，进行限制性酶切时都需要在 50 μl 反应总体系中，加入 1 μl 酶反应 1 小时来消化 1 μg 纯化的 DNA。但是，若选用 NEB Time-Saver 特性的酶，可以大大加速您的筛选进程。这些酶在建议反应条件下，加入 1 μl 就可以在5-15 分钟内消化 1 μg DNA。且这些酶在产品规格、浓度上没有任何改变，也不需要重新购买更贵的新产品来实现 5-15 分钟快速酶切，这与其他供应商的产品完全不同。温育时间过长你也不必担心。

为了向您提供更多信息，NEB 通过单位定义底物 DNA 和质粒 DNA 测试了所有酶的活性。只建议用作参考，不适用于所有的质粒。限制性内切酶通常显示出的位点优势效应，是由识别位点侧翼序列决定的。此外，超螺旋DNA 的切割速率变化很大，更多信息请参见网站的技术支持部分。注意以下有些内切酶可以在 5-15 分钟切割底物，但是不能用于过夜酶切，因此不具有 TimeSaver 特性。

由于所有 NEB 的酶都经过核酸酶污染的严格检测，您可以放心的进行长时间酶切而不必担心样品降解。只有NEB，可以提供给您如此高的效率和纯度，效率高—5-15 分钟实现快速酶切；纯度高—过夜酶切样品不损失。

省时内切酶的效率和纯度：

1 μl SalI 5 分钟内消化 1 μg DNA，结果显示长时间酶切或过夜 (O/N) 消化没有核酸酶污染。
Marker (M) 是 1 kb DNA Ladder (NEB #N3232) 。