免疫组库测序常常用来分析当下的和过去的免疫应答反应。最常应用领域包括：自身免疫性疾病的表征、肿瘤学、传染病中和抗体的发现、肿瘤浸润淋巴细胞以及用作研究残留病的工具。二代测序（NGS）平台在读长和通量方面的最新进展促进了免疫组库测序的发展。

NEBNext^® 免疫测序试剂盒通过对 B 细胞和 T 细胞全长免疫组库分析，能获得体细胞的所有突变信息。该试剂盒提供引物模块，可用于分析完整的 V、D、J 区域和 IgM、IgD、IgG、IgA、IgE 亚类，并分析 BCR 轻链、BCR 重链、TCRα 链和 TCRβ 链。该试剂盒还提供唯一分子标签序列（UMI），将来源于同一个分子的 PCR 产物组成共有序列，以便提高测序准确性，消除 PCR 偏差。Galaxy 平台提供一个开源软件工具——pRESTO，用于在本地或云端开展超强生物信息分析。为了确保不熟悉 Galaxy 平台的用户能成功使用分析软件，pRESTO 提供教学教程。

NEBNext^® 免疫测序方法的特点

• 制备可变序列的全长信息（包括亚类信息），使仅测序 CDR3 区域不能获得的下游抗体合成和功能信息成为可能。

• 取消可变区域引物的使用，降低了引物池的复杂度，实现了同步无偏差导出 B 细胞和 T 细胞受体转录本数据。

• 从相同转录本获得的重复数据，组成共有序列，降低 PCR 偏差，提高测序准确性；UMIs 能够准确定量样本中存在的每个克隆。

• 提高免疫组库测序的靶点捕获效率，优化在总 RNA 中，仅占微克量的免疫组库数据分析

抗体和 TCR 结构的简化示意图

免疫组建库流程

产品优势

• 通过对受体序列的深入分析，揭示复杂的免疫系统

• 对 B 细胞受体（BCR）和 T 细胞受体（TCR）进行富集和测序

• 制备 B 细胞和 T 细胞的全长免疫基因组库

• 使用唯一分子标签序列（UMI）准确定量转录本

• 使用用于生物信息流程（教程）的开源软件工具——pRESTO 分析数据

NEBNext^® 免疫测序试剂盒（人）部分数据展示

使用唯一分子标签序列（UMI）实现克隆型的精准检测。比较克隆型频率：使用 10 ng 和 100 ng T 细胞总 RNA 制备人类 TCR 文库，在有或没有 UMI 情况下分别建库。根据有 UMI 的测序结果，对前 100 个高表达克隆型进行排序。重复建库，克隆型频率重叠绘制于图中。每个条形或圆点代表一个克隆，该克隆经过总读长分析或使用 UMI 过滤。使用 UMI 可对原始样本中的起始 RNA 分子进行绝对定量。当将克隆按照富集度从高到底进行排序，没有 UMI 的数据会导致 PCR 或测序扩增的偏差，从而误导样本中克隆型频率的分析。UMI 的使用通过对起始样本中 RNA 的绝对定量来校正偏差。使用 UMI 也可以在重复本之间实现更好的相关性，尤其是起始量较低时。各个文库向下抽样 500,000 reads。

使用 NEBNext 免疫测序试剂盒（人），能够在同一管中制备人 BCR 和 TCR 文库。分别使用 1 μg、100 ng 和 10 ng 人 PBMC 总 RNA（Takara Bio #636592）制备人 BCR+TCR 文库，每个起始量都做有平行实验。所有文库向下抽样 950,000 reads。使用 pRESTO 工具完成 reads 过滤、序列组装和基于 UMIs 组成共有序列。使用 MiGMAP 鉴别 V、D 和 J 区域。图（A）表示每个人类 PBMC 总 RNA 起始样本检测到的克隆型数量。图（B）表示各文库中 B 细胞链和 T 细胞链所占百分比。

NEBNext^® 免疫测序试剂盒（小鼠）部分数据展示

使用唯一分子标签序列（UMI）实现克隆型的精准检测。在有或没有 UMI 情况下，比较小鼠 TCR 克隆型频率。根据有 UMI 的测序结果，对前 100 个高表达克隆型进行排序。在有或没有 UMI 情况下，重复建库，克隆型频率重叠绘制于图中。每个条形或圆点代表一个克隆，该克隆经过总读长分析或使用 UMI 过滤。使用 UMI 可对原始样本中的起始 RNA 分子进行绝对定量。当将克隆按照富集度从高到底进行排序，没有 UMI 的数据会导致 PCR 或测序扩增的偏差，从而误导样本中克隆型频率的分析。UMI 的使用通过对起始样本中 RNA 的绝对定量来校正偏差。使用 UMI 也可以在重复本之间实现更好的相关性，尤其是起始量较低时。各个文库向下抽样 500,000 reads。

使用 NEBNext 免疫测序试剂盒（小鼠），能够在同一管中制备小鼠 BCR 和 TCR 文库。分别使用 10 ng、100 ng 和 1,000 ng 小鼠脾脏总 RNA（Takara Bio #636605）制备小鼠 BCR+TCR 文库，每个起始量都做有平行实验。所有文库向下抽样 1,000,000 reads。使用 pRESTO 工具完成 reads 过滤、序列组装和基于 UMIs 组成共有序列。使用 MiGMAP 鉴别 V、D 和 J 区域。图（A）表示每个小鼠脾脏总 RNA 起始样本检测到的克隆型数量。图（B）表示各文库中 B 细胞重链（IGH）和轻链（IGK 和 IGL）以及 Tα 链（TRA）、β 链（TRB）、δ 链（TRD）和 γ 链（TRG）所占百分比。

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