基于模块化设计的 DNA 高通量组装助力合成生物学研究

合成生物学是一门交叉学科，未来很有可能对学术和工业方面的应用产生重大的影响，包括生产新型治疗药物和疫苗、植物科学和生物燃料。其中许多学科都需要利用基于生物学的化工生产能力，将工程学原理应用于生物学。其重点通常是从天然生物系统中产生、表征和分离某些天然物质（如 DNA），并将其用作工程化生物路径的组件。合成生物学的特点是将理性原则应用于这些生物组件的设计和组装，但即便是理性设计，引入外源 DNA 到细胞中的影响也很难预测，这就需要测试多种排列组合以获得期望的结果。加强对 DNA 片段的模块化设计，就可以通过替换单个组件的方式来实现多样化的潜在的组装构建。DNA 片段的模块化设计和组装不仅可以简化整体的 DNA 构建工作流程，还使自动化组装成为可能，减少完成多次构建所需的时间、人力和成本，从而提高通量，并缩短总体开发周期。

NEBuilder® 高保真 DNA 组装和 NEBridge® Golden Gate 组装引领着下一代克隆技术。这两种方法都兼容高通量工作流程，并已经成功通过自动化平台（例如 Labcyte®, Inc. 的 Echo® 525 液体处理系统和 SPT Labtech 的mosquito® LV 移液工作站）实现了高通量无缝克隆。

无缝组装结合 Labcyte®, Inc. 的 Echo® 525 液体处理系统

使用纳升级声波移液系统实现 PIK3CA 的模块化 DNA 组装

在此研究中，NEBuilder® HiFi 与 25 nL 移液量的 Labcyte Echo® 525 液体处理系统结合使用，来完成基于五个模块化片段，可以编码 PIK3CA 癌基因的组装构建。将这些模块设计为分别包含发生于野生型 PIK3CA 上的四个活化突变：R38H、E542K、E545K 和 H1047R，将其克隆到 pcDNA™3.1/Zeo(+) 载体上，组装成 8,940 bp 大小的质粒。本实验的目标是利用 Echo 525 液体处理系统，在纳升级别上完成五组五个片段的模块化 DNA 组装。该实验通过 junction 菌落 qPCR 快速分析验证是否组装成功，并通过 Illumina® MiSeq® 测序进行核苷酸水平上的验证。

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微型化多片段 DNA 组装

在此应用案例描述的研究中，NEB NEBuilder® 高保真 DNA 组装克隆试剂盒与 Labcyte® Echo® 525 液体处理系统结合使用，基于五个模块化片段进行 DNA 组装构建。反应体积可以缩小到说明书推荐体积的 1/40，从而显著节省试剂成本。在转化到大肠杆菌之中后，首先通过 junction 菌落 qPCR 检查组装构建是否成功，然后，采用微型化的 Illumina® MiSeq® Nextera XT 方案进行测序验证，从而进一步节省成本。

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利用 Labcyte® Echo® 525 液体处理系统和 NEBuilder 高保真克隆试剂盒进行纳升级DNA 组装

在该实验中，将 NEBuilder® 高保真组装试剂盒与 25 nL 移液量的 Labcyte® Echo® 525 液体处理系统相结合使用。通过组装构建两种独特的质粒，展示了基于合理设计的模块化合成生物学的优势。第一种组装包含两个片段，设计构建可以表达 LacZ 通路的 5223 bp 大小的质粒，并在转化到非 α 互补的菌株中时，能够进行蓝白斑筛选。第二种组装由五个片段构建 8,940 bp 大小的质粒，更接近典型工业 DNA 生产的复杂性和大小。两片段组装成功从 20 μL 推荐体积缩小到 100 nL，试剂用量只有原来的 1/200。对于更复杂的组装，反应体积成功降至原来的 1/80，而降至 1/40 时可以得到最稳健的结果。当反应体积减小到 1/40 时，总反应体积为 500 nL，每种 DNA 片段只需要 1.25 fmoles 的加入量。这些实验的目标是利用 Echo 525 液体处理系统，通过微量反应体积，完成两个片段和五个片段的组装构建。通过 junction qPCR 快速分析验证组装是否成功，并通过 Sanger 测序在核苷酸水平上进行验证。

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无缝组装结合 SPT Labtech 的 mosquito® LV 移液工作站

基于自动化高密度样本存储与微型化液体处理系统的高通量合成生物学组装构建

本应用案例描述了一种自动化、高通量的工作流程，该工作流程已由 GeneMill 合成生物学服务中心（由 James Johnson 博士领导，位于利物浦大学）集成用于构建合成 DNA。

通过将 arktic 自动化样本管理系统与 mosquito X1/LV 小体积液体处理系统相结合，可以简化和加速 GeneMill 现有的手动工作流程。这拓展了该核心机构的 DNA 合成能力，有助于合成生物学研究人员获得更多经过验证的实验工具。

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NEB 正在不断将 NEBuilder® 高保真 DNA 无缝组装和 NEBridge® Golden Gate 无缝组装结合更多的自动化平台、多种组装构建设计和应用场景进行测试验证，致力于以低成本的方法和工作流程，构建高质量的合成 DNA，从而以较高的通量拓展基于设计的实验测试，并为科学家的研究提供更丰富的生物学场景。